随着上一篇推文，我们看到了阴道菌群还在扩展的“千人千面”，也进一步揭示了不同的阴道菌群类型对于女性健康的影响，同时我们也了解到，阴道菌群类型由诸多先天和后天因素最终塑造而成，正像我们看到的每一片树叶最终所呈现的不同形状。
有了延时摄影技术，可以让我们观察到，每一片叶子是如何长成了今天的模样，那么如果我们能观察到阴道菌群是如何一步步演化到了当前的状态，又会为未来的健康开启一条怎样的道路？
北京协和医院朱兰教授团队与华大生命科学研究院等联合在Nature子刊Nature Communications发表论著，阐述了MRKH综合征（后文注）患者接受腹膜法人工阴道成形术后新阴道菌群的形成过程。本期的内容，我们继续“追星”之旅，来一起见证阴道菌群的演化之路。
微生物是人类最密切的伙伴，在我们甚至还未出生时，它们就已经开始在人类身上定植，并在之后逐步发育和壮大，最终组成了人体内的几大微生态群落，如肠道微生态，口腔微生态以及阴道微生态等。之前的一些研究中也显示，剖宫产的婴儿与正常阴道分娩的婴儿，肠道菌群结构完全不同。那么，阴道的菌群的形成在最初是怎样的？对未来有哪些影响？而本次研究中MRKH综合征患者通过手术构建的人工阴道，为研究阴道微生物群的建立提供了独特的机会。
MRKH（Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser）综合征是一种罕见的先天性女性生殖系统畸形，表现为先天性无子宫颈无阴道合并单侧或双侧始基子宫。基于是否伴随其他系统畸形，可分为两类即Ⅰ型（单纯型/典型MRKH）和Ⅱ型（复杂型/非典型MRKH），具体规则这里不多赘述。
人工阴道是通过手术构建的阴道，是用于矫正患有MRKH综合征女性的子宫阴道发育不全的最理想方案，此外，该手术还被用于作为跨性别女性性别肯定（男子变性）手术的一部分。新的人工阴道，正如一片新的土壤，通过观测其微生态的变化，我们便能知道微生物在其中如何定植，如何生长。目前已有少数横断面研究主要通过培养和显微镜检查来探究人工阴道的微生物群，如在跨性别者的人工阴道上，其通常存在多种微生物环境，且与正常女性阴道呈显著差异，反而与阴茎上微生物菌群相似。
此外，有研究显示，人工阴道术后数年其微生物群存在生态失调，只有在鳞状上皮形成后，乳酸杆菌会增多，这或许和阴道鳞状上皮细胞内糖原相关。本次研究通过对腹腔镜下腹膜阴道成形术后MRKH综合征女性的人工阴道微生物群发展过程进行详细的时空分析，揭示了人工阴道微生物群与术前凹陷处微生物群之间的复杂联系，并强调了人工阴道环境的逐步演变所产生的选择性压力，以及阴道菌种的定植趋向性所发挥的关键作用。
图 1 ：研究设计与人工阴道上皮发育的示意图概述
Part.2 研究设计与人工阴道的形态学特征
本次研究招募了39名中国MRKH综合征女性（手术时年龄为17-35岁），并对其进行随访，在腹腔镜下腹膜阴道成形术术前（PRE：术前0-2天）及术后长达2-4年的4个时间点（14.11±2.04 天；91.56±7.76 天；8.79±2.50 个月；42.81±8.18 个月）采集多部位纵向样本（图 1a）并进行深度鸟枪法宏基因组测序分析。
其中包括142份阴道样本，为了进一步确定人工阴道中微生物的来源，还同步取了31份腹膜液样本、111份粪便样本、108份舌苔样本、33份腹部皮肤样本及31份对照生理盐水样本（环境监测）总计456份样本。
随着人工阴道上皮形成过程的推进，其状态与绝经前及绝经后女性正常阴道的情况呈现出一定程度的相似性和相关性。因此，研究者又额外收集了中国健康女性正常阴道的微生物群数据。为避免围绝经期的波动对分组造成干扰，本次研究排除了45至55岁的个体，最终纳入237名绝经前女性（年龄39.99±2.54岁）和235名绝经后女性（年龄58.09±3.86岁），作为对照参考群体（图 1a）。
Part.3 MRKH 患者人工阴道内的微生物群聚集
首先通过对MRKH患者术前阴道凹陷及术后人工阴道的微生物群进行了特征分析，并与绝经前和绝经后女性的阴道微生物群进行对比发现：阴道凹陷中丰度最高的菌种包括惰性乳酸杆菌（Lactobacillus iners）、蒂莫内普雷沃菌（Prevotella timonensis）、阴道阿托波菌（Atopobium vaginae）、比维普雷沃菌（Prevotella bivia）、卷曲乳酸杆菌（Lactobacillus crispatus）、迪氏普雷沃菌（Prevotella disiens）和阴道加德纳菌（Gardnerella vaginalis）（图2a），这些菌种的平均相对丰度占比超过75%，且均位列健康对照群体微生物群的前10位。
总体而言，术前阴道凹陷的微生物群与绝经前女性和绝经后女性的阴道微生物群均存在一定相似性：与绝经前女性一样的是其惰性乳酸杆菌丰度较高；而与绝经后女性相似的则是其包含一些细菌性阴道病（BV）相关菌种（包括阴道加德纳菌和普雷沃菌属菌种），且这些菌种的占比也较高（图2）。
图2：MRKH患者新阴道微生物群组装过程中的组成动态变化
a-f：不同阶段 / 群体的阴道微生物群整体组成
若仅考虑平均相对丰度>1‰的菌种，MRKH患者术前阴道凹陷及术后人工阴道中的细菌大多为常见的“原生”阴道菌种（江山易改，菌群难易......）。但是，从术后“一贫如洗”到“回满血”大概需要分三个阶段：
一阶段：术后14天时，人工阴道的局部环境处于剧烈变化期。主要由于围手术期用药的影响包括泻药、石蜡油及预防性抗生素（头孢西丁联合甲硝唑或克林霉素等）。在这一时间点菌种数量急剧减少，且惰性乳酸杆菌、蒂莫内普雷沃菌和阴道阿托波菌的相对丰度也显著下降（图 2a、b），但在部分患者中，几种本质上对所用头孢菌素不敏感或具有耐药性的菌种大量繁殖，包括粪肠球菌、微小脲原体、解脲脲原体及人型支原体。（图2g）（山中无“老虎”，“猴子”成霸王）。
尽管术后14天的菌群发生了剧烈变化，但相邻时间点之间的个体内差异仍显著低于个体间差异（图 2h），这表明菌群在聚集过程中存在内在的连续性。
图2：g：MRKH患者不同时间点的 “阴道类型（vagitype）” 分布
h：相邻时间点的个体内与个体间差异
i：术前与不同术后时间点的差异
二阶段：术后90天-12个月，术后90天时当鳞状上皮延伸至人工阴道顶端，菌群进入多种微生物共存状态，且与细菌性阴道病（BV）相关的菌种变得丰富（图2c）。值得注意的是，普雷沃菌属（主要以蒂莫内普雷沃菌和比维普雷沃菌为代表）（图2c）的相对丰度显著增加，平均占比达到约29%。阴道加德纳菌和阴道阿托波菌（BV菌群中的黄金搭档）的平均相对丰度也有所上升；在成功随访的11名患者中，到术后6-12个月时，阴道加德纳菌甚至成为丰度最高的菌种。总体而言，术后90天和6-12个月这两个中间阶段的特征是：
乳酸杆菌属菌种水平较低，而与细菌性阴道病相关的厌氧菌水平较高，仅有少数患者的菌群组成以乳酸杆菌属菌种为主（图 2g）。
三阶段：术后2至4年，神奇的事情发生了，新阴道菌群并未延续类似细菌性阴道病（BV）的状态，而是呈现出与术前凹陷处（dimple）最接近的状态 —— 在丰度排名前20的菌种中，仅口腔普雷沃菌的相对丰度存在显著差异（图2a、d、i）。
在这一时间点，所有回访患者的新阴道中均已定植惰性乳杆菌（L. iners）。与早中期相比，惰性乳杆菌、卷曲乳杆菌以及整个乳杆菌属的相对丰度均显著增加，使得术后2至4年时的乳杆菌水平与凹陷处水平相当，但低于健康育龄女性正常阴道中的水平（75.6%），高于健康绝经后女性（17.1%）水平。
从术前术后的菌群对比看，人工阴道的菌群似乎是来自之前的阴道凹陷处，就像被火烧过后重新长出的草原。而事实上通过FEAST分析（注：一种快速准确的进行微生物来源分析的方法），人工阴道微生物群中占比最大的部分确实来自术前阴道凹陷的微生物群，其占比从术后14天的40.76%稳步上升至术后2-4年的 79.30%；此外还有部分来自隔壁的粪便微生物群，平均占比为22.09%。
在人工阴道构建过程中，由于腹膜液与用于覆盖解剖面的腹膜直接接触，其贡献占比在术后90天达到最高值2.17%，而在术后2-4年降至微乎其微的水平。在早中期阶段，舌苔微生物群的预计贡献占比也极低（笔者也没想通这隔得这么远的地方为啥要研究，有可能是考虑其对粪便微生物群的间接影响？）。尽管腹膜液、口腔及未知来源的潜在贡献占比下降，但在术后2-4年，皮肤微生物群和环境对照的贡献估计值变得显著。总体而言，FEAST的估计结果与人工阴道中丰度最高的10种菌种在每种样本类型中所占的平均相对丰度高度一致。
为了进一步确认各菌株的来源，研究者们统计了人工阴道存在菌株共享的患者数量，并将菌种分为四类（图 4 ）：
1.仅存在阴道内（凹陷 - 人工阴道）菌株共享的菌种（4/75，5.3%），包括被广泛认为是健康阴道微生物群关键菌种的卷曲乳酸杆菌（L. crispatus），这表明在本观察性研究中，该菌种的主要来源是阴道凹陷。
2.同时存在阴道内和阴道外（粪便、皮肤和舌苔）菌株共享的菌种（21/75，28%）。此类菌种占菌株共享事件的大多数，主要见于阴道凹陷与粪便微生物群之间，偶尔也见于皮肤微生物群（如惰性乳酸杆菌（L. iners）和大芬戈尔德菌（Finegoldia magna））。在这些菌种中，惰性乳酸杆菌、微小脲原体（U. parvum）、比维普雷沃菌（P. bivia）、抗齿放线菌组（S. antinosus group）和迪氏普雷沃菌（P. disiens）在阴道凹陷和粪便中的共享数量及共享率最高（50%-100%）。这表明这些菌种能很好地适应肠道和阴道环境。
3.仅存在阴道外菌株共享的菌种（35/75，46.7%）。此类菌种中，除1例外，所有菌株共享事件均与粪便有关；大多数菌种的共享数量较低，但共享率较高，尤其是那些典型的肠道微生物群菌种。
4.未检测到与所有调查来源存在菌株共享的菌种（15/75，20%）。
图5：人工阴道内菌株传播的时间动态分析
a：术后14天（P14D）人工阴道中推定的菌株传播来源（红色：检测到 “菌株传递”（即 P14D 人工阴道中的菌株与术前某部位的菌株为同一菌株）；蓝色：未检测到菌株传递（即 P14D 人工阴道中的菌株与术前某部位的菌株为不同菌株）。）
b：菌株的长期留存（从术前或术后 1 年内至术后 2-4 年）
将术后14天的菌株与术前阴道凹陷及粪便微生物群中的菌株进行比较，还会发现人工阴道内的菌株与阴道凹陷的菌株同源性更高；其中惰性乳酸杆菌、微小脲原体、阴道加德纳菌（G. vaginalis）、羊膜斯奈瑟菌（Sneathia amnii）和羊膜普雷沃菌（P. amnii），菌株共享仅存在于与阴道凹陷之间（图 5a）。而与术前粪便微生物群的共享较少，且通常涉及普雷沃菌属菌种（图 5a）。综上，这些结果表明，尽管粪便微生物群作为直接来源或中间传递者，对人工阴道的定植作出了显著贡献，但阴道凹陷微生物群仍是主要的储存库。这提示阴道菌种具有定植趋向性和生态位特异性。
Part.5 影响MRKH患者 人工阴道微生物群聚集的因素
前面我们知道MRKH患者的阴道微生物群存在显著异质性，而且其来源大多还是之前的阴道凹陷部位，少部分来自粪便/肠道。正如被大火烧过的白地重新长成草原，除了需要种子外，还需要水和养分等等，那么哪些因素会影响人工阴道微生物群发展的因素？
首先看“土壤”情况（MRKH 分型）：研究者们继续分析了各元数据变量的影响后发现，尽管MRKH分型对整体菌群结构变异无显著影响，但与多种菌种的相对丰度显著相关，包括小阿托波菌（Atopobium minutum）、齿双歧杆菌（Bifidobacterium dentium）、蒂莫内普雷沃菌（P. timonensis）和无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）（图 6a）。
图6：影响MRKH患者人工阴道微生物群的因素
a：与MRKH分型显著相关的菌种关联分析
b：术前菌群状态与人工阴道菌群丰度的相关性
c：人工阴道菌种相对丰度变化的预测准确率
前面我们知道人工阴道的微生物群与术前阴道凹陷微生物群的相似度随时间推移而增加，但从细节上看并非所有患者均呈现一致的个体内相似度。鉴于阴道凹陷和粪便微生物群均为人工阴道定植提供了重要的菌种库，研究者们进一步分析了这两个部位中特定菌种的术前状态（存在/缺失或相对丰度）对其在人工阴道中相对丰度的影响。值得注意的是，所有显著相关性均呈正相关，且大多数与阴道凹陷中的术前状态相关（10种仅与凹陷相关，3种仅与粪便相关，3种与两者均相关）（图6b）。例如，卷曲乳酸杆菌（L. crispatus）在术前阴道凹陷中的定植状态不仅在很大程度上决定了其能否在人工阴道中定植（尤其在术后第1年），还显著影响其术后相对丰度（图6b）。对于其他菌种，如微小脲原体（U. parvum）、比维普雷沃菌（P. bivia）和阴道阿托波菌（A. vaginae），尽管检测到它们与阴道凹陷和粪便均存在菌株共享，但它们在人工阴道中的相对丰度仅与术前阴道凹陷中的状态显著相关（图4、图 6b）。有趣的是，这种关联模式甚至见于某些仅存在粪便 - 人工阴道菌株共享的菌种，如普拉梭菌（Faecalibacterium prausnitzii）（图4、图 6b）。
在与术前粪便中菌种水平显著相关的6种菌中（包括惰性乳酸杆菌（L. iners）、躯体普雷沃菌（P. corporis）、柯氏普雷沃菌（P. copri）、杜氏消化链球菌（Peptoniphilus duerdenii）、阴道厌氧球菌（Anaerococcus vaginalis）和普氏厌氧球菌（Anaerococcus prevotii）），惰性乳酸杆菌的情况最为特殊（图 6b）。该菌在术前和术后2-4年均具有高流行率和高丰度，且从阴道凹陷的推定传播率也较高。然而，其在人工阴道中的相对丰度与术前阴道凹陷中的状态并无相关性（图4）（再次印证了惰性乳杆菌除了刷存在感，该干活的时候一点靠不住......）。类似的还有如蒂莫内普雷沃菌（P. timonensis）、迪氏普雷沃菌（P. disiens）、阴道加德纳菌（G. vaginalis）、解脲梭杆菌（C. ureolyticus）、大芬戈尔德菌（F. magna）和哈氏消化链球菌（Peptoniphilus harei），尽管频繁与阴道凹陷和粪便存在菌株共享，但与术前在这两个部位的状态均无显著关联（图 4、图 6b）。
然而，基于前一时间点的细菌组成，使用随机森林模型对相对丰度的时间变化进行多变量预测分析显示，这些菌种的预测准确率最高，其次是惰性乳酸杆菌（L. iners）（图6c），这凸显了阴道凹陷微生物群与人工阴道微生物群之间相互作用的复杂性（就好像现实中的指挥者和下面干活的）。更重要的是，这种可预测性结果与术后 2-4 年菌群偏向性转变一致。
不愧是Nature的深度，从研究设计的巧思，到分析的细致入微且层层深入，为我们揭示了一个生态系统从无到有以及日趋复杂的演化过程。简单来说，新阴道刚形成时，几乎是一个空白的生态位，这使得相邻解剖区域的微生物得以涌入，其中凹陷处和肛门区域的微生物群是主要的菌种库，与此同时，局部环境也在快速转变，如阴道内上皮的转变，形成了一个动态的营养环境，对定植的微生物施加着持续的选择压力，并最终回复到术前的状态。这其中菌种之间，菌群与宿主及环境之间的相互作用值得深思，如普雷沃菌，作为探路者，在术后90天时，以该菌种为核心的初始网络结构就已建立，而后其优势地位却逐渐被乳杆菌所取代（考虑到正常阴道中BV则很难自发的回复到正常菌群状态，这或许也和益生元等治疗BV有一定的类似机制）。
在实际应用方面，既然术后新的阴道菌群更多的会回复到之前的状态，那么在术后早期向凹陷处或新阴道局部引入卷曲乳杆菌菌株，或许能够促进该菌种的定植，并对阴道成形术后新阴道微生物群的组装结果产生有益影响。
参考文献：Na Chen，et al. Insights into the assembly of the neovaginal microbiota in Mayer-Rokitansky-KüsterHauser (MRKH) syndrome patients.Nature Communications | (2024) 15:7808,
